Asam amino merupakan unit pembangun protein yang
dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari
atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Dari keseluruhan asam amino
yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada
protein.
Gambar 1. Struktur molekul asam amino
Dari
struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu
gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar.
Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat
spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini
akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai
contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat
amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa
kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat.
Semua asam
amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan
amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang
lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik,
dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik
yang melibatkan gugus R-nya.
Melalui
reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi
berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut : asam amino
non-polar dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin,
Prolin, Fenilalanin, Triptofan dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino
polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan Lisin, Serin, Treonin,
Sistein, Tirosin, Asparagin dan Glutamin. Golongan ketiga yaitu asam amino yang
bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino yang
bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai
delapan macam asam amino esensial yaitu valin, leusin, Isoleusin, metionin,
Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa
disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus didapatkan dari luar
seperti makanan dan zat nutrisi lainnya.
Tujuan
Percobaan
Percobaan
ini bertujuan untuk mempelajari beberapa reaksi uji terhadap asam amino dan
protein.
Bahan dan
Alat
Alat
- tabung reaksi
- gelas piala
- pipet tetes
- pipet Mohr
- kertas saring
- corong
- penangas air
- Bahan:
- Albumin
- Gelatin
- Kasain
- Pepton
- Fenol
- Pereaksi millon
- Pereaksi Hopkins cole
- Pereaksi biuret
- H2SO4
- NaOH
- HNO3
- CuSO4
- HgCl2
- AgNO3
- (NH4)2SO4
- HCl
- Pb-asetat
- Etanol
- Asam asetat
- Buffer asetat pH 4,7
Cara kerja:
- Uji Millon
Sebanyak 5 tetes pereaksi Millon
ditambahkan ke dalam 3 mL larutan protein, dipanaskan. Uji dilakukan terhadap
larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%.
- Uji Hopkins-Cole
Sebanyak 2 mL larutan protein
dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole dalam tabung reaksi. Ditambahkan 3 mL
H2SO4 pekat melalui dinding tabung sehingga membentuk lapisan dari cairan.
Didiamkan, setelah beberapa detik akan terbentuk cincin violet (ungu) pada
pertemuan kedua lapisan cairan, apabila positif mengandung triptofan. Uji
dilakukan terhadap larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, dan pepton 2%.
- Uji Xanthoproteat
Sebanyak 2 mL larutan protein
ditambahkan 1 mL HNO3 pekat, dicampur, kemudian dipanaskan, diamati timbulnya
warna kuning tua. Didinginkan, ditambahkan tetes demi tetes larutan NaOH pekat
sampai larutan menjadi basa. Diamati perubahan yang terjadi. Uji dilakukan
terhadap larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%.
- Uji Biuret
Sebanyak 3 mL larutan protein
ditambah 1 mL NaOH 10% dan dikocok. Ditambahkan 1-3 tetes larutan CuSO4 0.1%.
Diamati timbulnya warna.
Pada pengendapan protein oleh logam, oleh garam, oleh
alkohol, uji koagulasi dan denaturasi protein. Kedalam 3 ml albumin ditambahkan
5 tetes larutan HgCl2 2%, percobaan diulangi dengan larutan Pb-asetat 5%, dan
AgNO3 5%. Sepuluh ml larutan protein dijenuhkan dengan amonium sulfat yang
ditambahkan sedikit demi sedikit, kemudian diaduk hingga mencapai titik jenuh
dan disaring. Lalu diuji kelarutannnya dengan ditambahkan air, untuk endapan
diuji dengan pereaksi Millon dan filtrat dengan pereaksi biuret. Ditambahkan 2
tetes asam asetat 1 M ke dalam tabung yang berisi 5 ml larutan protein,
kemudian tabung tersebut diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit. Lalu
diambil endapan dengan batang pengaduk, untuk endapan diuji kelarutannya dengan
air , sementara endapan dengan pereaksi Millon. Disiapkan 3 tabung reaksi,
tabung pertama diisi campuran sebagai berikut ; 5 ml larutan albumin, 1 ml HCl
0,1 M dan 6 ml etanol 95%. Ke dalam tabung kedua dimasukkan5 ml larutan
albumin, 1 ml NaOH 0,1 M dan 6 ml etanol 95%. Ke dalam tabung ketiga 5 ml
larutan albumin, 1 ml buffer asetat ph 4,7 dan 6 ml etanol 95%.
Pada
percobaan denaturasi protein siapkan 3 tabung reaksi, tabung reaksi pertama
diisi 9 ml larutan albumin dan 1ml HCl 0,1 M, tabung reaksi kedua 9 ml larutan
albumin dan 1 ml NaOH 0,1 M dan kedalam tabung reaksi ketiga ditambahkan hanya
1 ml buffer asetat pH 4,7.
Data dan Hasil
Pengamatan
Tabel 1.
berbagai uji kualitatif pada beberapa larutan protein
|
Larutan Protein
|
Millon
|
Hopskin-cole
|
Xantoproteat
|
Biuret
|
|
Albumin
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
Gelatin
|
-
|
+
|
+
|
+
|
|
Kasein
|
+
|
+
|
-
|
+
|
|
Pepton
|
-
|
+
|
+
|
+
|
|
Fenol
|
-
|
Tidak diuji
|
+
|
-
|
Keterangan:
(-) = uji negatif
(+) = uji positf (Millon: larutan berwarna merah, terbentuk garam merkuri dari
tirosin yang ternitrasi; Hopkins-Cole: terbentuk cincin violet, adanya
triptofan; Xanthoproteat: terbentuk warna kuning tua, adanya gugus benzena; dan
Biuret: terbentuk warna violet).
Tabel 2.
Pengaruh penambahan logam berat pada albumin
Keterangan:
(+) = terbentuk endapan
Tabel 3.
Pengendapan protein oleh garam (NH4)2SO4
Tabel 4. Uji
Koagulasi pada protein
Tabel 5.
Pengendapan protein oleh alkohol
Keterangan:
- tabung I berisi 5 ml albumin, 1
ml HCl 0,1 M dan 6 ml etanol 95 %
- tabung II berisi 5 ml albumin,
1 ml NaOH 0,1 M dan 6 ml etanol 95%
- tabung III berisi 5 ml albumin,
1 ml buffer asetat pH 4,7 dan 6 ml etanol 95%
- (+): Terbentuk endapan
- (-): Tidak terbentuk endapan
Tabel 6.
Denaturasi protein oleh penambahan berbagai senyawa
Keterangan:
- tabung I berisi 9 ml albumin, 1
ml HCl 0,1 M
- tabung II berisi 9 ml albumin,
1 ml NaOH 0,1 M
- tabung III berisi 1 ml buffer
asetat pH 4,7
- (+): Terbentuk endapan
- (-): Tidak terbentuk endapan
Pembahasan
Pada
berbagai uji kualitatif yang dilakukan terhadap beberapa macam protein,
semuanya mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein,
yaitu asam amino tentunya. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik
pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi tersebut dapat diketahui komponen asam
amino suatu protein.
Prinsip dari
uji millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi.
Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya,
yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Dari hasil percobaan,
diketahui bahwa protein albumin dan kasein mengandung Tirosin sebagai salah
asam amino penyusunnya, sedangkan gelatin dan pepton tidak. Fenol dalam hal ini
digunakan sebagai bahan percobaan karena Tirosin memiliki molekul fenol pada
gugus R-nya. Di sini, uji terhadap fenol negatif, walaupun secara teori tidak.
Alasan yang mungkin untuk hal ini adalah kesalahan praktikan dalam bekerja.
Pada uji
Hopkins cole, uji positif ditunjukkan oleh albumin, gelatin, kasein, dan
pepton, dengan ditunjukkan oleh adanya cincin berwarna ungu. Uji ini spesifik
untuk protein yang mengandung Triptofan. Triptofan akan berkondensasi dengan
aldehid bila ada asam kuaat sehngga membentuk cincin berwarna ungu.
Protein yang
mengandng sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus asam amino bebas akan
bereaksi dengan ninhidrin membentuk persenyawaan berwarna. Uji ini bersifat
umum untuk semua asam amino, dan menjadi dasar penentuan kuantitatif asam
amino. Pada uji ini, hanya kasein yang menunjukkan uji negatif terhadap
ninhidrin. Hal ini disebabkan karena pada kasein tidak mengandung sedikitnya
satu gugus karboksil dan amino yang terbuka.
Sistein dan
Metionin merupakan asam amino yang mengandung atom S pada molekulnya.. Reaksi
Pb-asetat dengan asam-asam amino tersebut akan membentuk endapan berwarna
kelabu, yaitu garam PbS. Penambahan NaOH dalam hal ini adalah untuk
mendenaturasikan protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat
terputus oleh Pb-asetat membentuk PbS. Dari semua bahan yang diuji, hanya
albumin yang membentuk endapan PbS, sehingga dapat disimpulkan albumin
mengandung Sistein ataupun Metionin.
Inti benzena
dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena.
Fenilalanin, Tirosin, dan Triptofan yang mengandung inti benzena pada
molekulnya juga mengalami reaksi dengan HNO3 pekat. Untuk perbandingan, dapat
ditunjukkan oleh fenol yang bereaksi membentuk nitrobenzena. Hasil uji
menunjukkan bahwa dari semua bahan, hanya kasein yang tidak mengandung asam
amino yang mempunyai inti benzena pada molekulnya. Tetapi hal ini patut
dipertanyakan, karena dari data-data yang diperoleh pada uji millon dan uji
Hopkins cole, kasein mengandung tirosin dan triptofan. Salah satu alasan yang mungkin
adalah karena kesalahan kerja praktikan dalam mengamati warna yang terbentuk
selama reaksi.
Pada uji
biuret, semua protein yang diujikan memberikan hasil positif. Biuret bereaksi
dengan membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino
dalam protein. Fenol tidak bereaksi dengan biuret karena tidak mempunyai gugus
-CO dan -NH pada molekulnya.
Protein yang
tercampur oleh senyawa logam berat akan terdenaturasi. Hal ini terjadi pada
albumin yang terkoagulasi setelah ditambahkan AgNO3 dan Pb-asetat.
Senyawa-senyawa logam tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan
dengan protein membentuk endapan logam proteinat. Protein juga mengendap bila
terdapat garam-garam anorganik dengan konsentrasi yang tinggi dalam larutan
protein. Berbeda dengan logam berat, garam-garam anorganik mengendapkan protein
karena kemampuan ion garam terhidrasi sehingga berkompetisi dengan protein
untuk mengikat air. Pada percobaan, endapan yang direaksikan dengan pereaksi
millon memberikan warna merah muda, dan filtrat yang direaksikan dengan biuret
berwarna biru muda. Hal ini berarti ada sebagian protein yang mengendap setelah
ditambahkan garam.
Pada uji
koagulasi, endapan albumin yang terjadi setelah penambahan asam asetat, bila
direaksikan dengan pereaksi millon memberikan hasil positif. Hal ini
menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, hanya saja
telah terjadi perrubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein
tersebut mengendap. Perubahan struktur tesier albumin ini tidak dapat diubah
kembali ke bentuk semula, ini bisa dilihat dari tidak larutnya endapan albumin
itu dalam air.
Pada uji
pengendapan oleh alkohol, hanya tabung-tabung yang mengandung asam (ber-pH
rendah) yang menunjukkan pengendapan protein. Pada protein, ujung C asam amino
yang terbuka dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana asam membentuk senyawa
protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukkan oleh adanya endapan yang
terbentuk.
Protein akan terdenaturasi atau mengendap bila berada pada titik isolistriknya,
yaitu pH dimana jumlah muatan positif sama dengan jumlah muatan negatifnya.
Pada uji denaturasi, protein yang dilarutkan dalam buffer asetat pH 4,7
menunjukkan adanya endapan. Protein yang dilarutkan dalam HCl maupun NaOH,
keduanya tidak menunjukkan adanya pengendapan, namun setelah ditambahkan buffer
asetat dengan volume berlebih, protein pun mengendap hal ini menunjukkan bahwa
protein albumin mengendap pada titik isolistriknya, yaitu sekitar pH 4,7.
Kesimpulan
Protein dan
asam amino memberikan reaksi yang bersifat khas, bukan hanya bagi gugus amino
dan gugus karboksil bebas, tetapi juga bagi gugus R yang terkandung di
dalamnya. Protein dapat bereaksi dengan pereaksi-pereaksi lain seperti juga
asam amino yang menjadi penyusunnya. Protein dapat mengendap atau terdenaturasi
oleh logam berat, garam-garam anorganik, rusaknya struktur tersier dan
kwartener, serta karena berada pada titik isolistriknya